1. 始终使用新鲜的试剂和耗材
高质量的文库制备是成功的ChIP-seq实验的关键。文库制备当天准备新鲜试剂非常重要,特别含有可从大气中吸收水份的乙醇等试剂。对于凝胶切除,始终确保使用新的干净的手术刀。文库制备试剂盒包含在室温下易高度降解的酶,影响实验的反应效率。确保酶储存在适当的温度,并在使用后立即冷藏储存,以确保酶的稳定性。为使样品回收率最大化,使低吸附试管,可显着降低DNA与塑料制品的表面结合。

2. 总是使用荧光测定法量化DNA
文库制备之前必须准确量化DNA。传统的分光光度计不能精确定量低浓度的ChIP DNA。使用嵌入染料的荧光技术定量DNA更准确,且灵敏度远高于分光光度计。DNA的精确定量对于ChIP和下一代测序(NGS)至关重要,Chromatrap®推荐使用荧光测定法。

3.确保100-300 bp之间的高质量剪切染色质
任何ChIP实验的成功高度依赖于制备的染色质的质量。对于ChIP-seq,染色质必须在100-300bp之间。Chromatrap®使用水浴超声波在高功率设置30秒脉冲15分钟产生100-300bp的染色质片段。确保样品在OFF阶段保持稳定的4℃。剪切条件需要由用户在开始免疫沉淀之前进行优化。建议使用微流体平台(如安捷生物分析仪高灵敏度DNA试剂盒)进一步验证,以确保ChIP样品具有预期的大小范围和浓度。
 
4. 始终使用经ChIP-seq验证的抗体

抗体的质量对于产生精确数据是至关重要的。确保抗体经过ChIP-seq验证,因为经验证其他应用的抗体可能不适用于NGS。高度特异性抗体将增加靶基因的相对富集,使得在数据分析期间更容易检测绑定结合。许多商业上可获得的抗体被列为ChIP-seq级别,尽可能的情况下,应用于您的实验。Chromatrap®ChIP Seq试剂盒提供阳性(H3K4me3)和阴性(IgG)抗体对照,以帮助验证样品的测序。 Chromatrap®还提供抗体验证服务,有关详细信息,请联系Chromatrap®客户支持。

5. 始终使用高灵敏度套件进行文库验证
文库准备的开始和结束时,您的样本大小分布应使用Agilent Bioanlyzer进行验证。始终使用高灵敏度DNA试剂盒,以确保DNA的高质量和被准确量化。请记住,在准备过程中连接的任何适配器将增加样品的重量,并且在进行大小选择时应考虑。对于尺寸选择,Chromatrap®建议使用SYBR®Gold作为核酸染色试剂,因为它的灵敏度高。当使用凝胶时,在样品之间留出空的孔,并记住使样品带有梯度以确保凝胶均匀流动。

6. 文库制备前的DNA
典型的ChIP实验产生5-200ng DNA,需要约107个细胞。Illumina文库制备指南建议使用5-10 ng的ChIP DNA,但是,我们发现,将起始量从10 ng增加到25 ng可显着降低PCR重复序列。 因此Chromatrap®建议使用25 ng IP DNA进行文库合成

7. 始终准备对照
在序列分析期间鉴定的峰必须与匹配的对照样本中的相同区域进行比较,以验证它们的显著性。例如,重复序列的随机区域可能由于该区域的拷贝数而变得富集,从而产生假阳性结果。有三种常用的对照:input DNA(未被免疫沉淀的DNA);mock IP(在IP期间DNA处理相同但无抗体); 和非特异性IP(用靶向未知参与DNA结合的蛋白质的抗体的IP,例如IgG)。对于哪种对照最适合使用没有一致意见,但是,Chromatrap®建议使用input DNA来解释与剪切相关的偏差,并且通常用于同行评审的期刊。

8.在测序前始终通过qPCR验证
在开始文库合成之前,我们建议通过qPCR分析免疫沉淀的DNA,使用至少一个您选择的基因特异性阳性和阴性对照。 Chromatrap®为GAPDH提供了阳性对照引物组,已被验证用于阳性对照抗体H3K4me3,以验证结果。

9. 磁珠的制备
所有文库制备试剂盒使用磁珠,应在使用前立即彻底涡旋并平衡至室温。不要过度干燥磁珠,因为这可能使重悬浮困难,并阻碍适当的洗脱。当珠子开始在球团内显示“裂缝”时,这是重新悬浮的好时机。

10. 阈值分析途径?
在peak-calling软件用于鉴定富集区域之前,读数必须映射到参考基因组。通过检查已知结合位置内的映射序列读数可以获得ChIP-seq质量的初始印象。更详细的分析需要使用专用的软件算法和Chromatrap®ChIP-seq数据分析软件允许读取比对和峰调用窄和宽峰标记,如转录因子和组蛋白修饰。用户还可以比较基因列表来鉴定其数据集中唯一或共同富集的特定靶。